利用crispr rnps高通量平台研究人类t细胞中hiv病毒的作用功能研究

【背景】

将体外融合的crispr rnps通过电穿孔的方法,对人体的cd4+ t细胞成功实现基因组编辑。为了了解细胞中hiv病毒和人类宿主细胞之间的相互作用,使用crispr rnps高通量平台实现对宿主细胞中的候选基因高效有序的编辑。使用这种新的基因工具不仅可以成功实现cd4+ t细胞中的基因编辑,同时还可以实现高效的、成对的基因敲除。crispr rnps高通量平台最大的优势是高效、大量、有序的筛选出与某些表型相关的候选基因,该技术能够促进药物靶标确认和细胞水平上hiv病毒感染的治疗。

【方法】

  1. 编辑人类t细胞中的hiv病毒的宿主因素
  2. 使用96孔板体外合成不同的cas9 rnps重组蛋白,并通过电穿孔的方法将其转入到人类cd4+细胞中可以在一个血液样本中快速的产生几百个不同的,转基因修饰池。
    实验流程:从人体血液中纯化出cd4+ t细胞,在抗cd3/cd28刺激下激活;使用电穿孔法将cas9 rnps转入,在dna和蛋白水平上检测基因组编辑情况;这些被编辑过的细胞群体通过多种hiv病毒注射实验来检测功能(图1)。
    使用多重平台在人类cd+细胞中编辑hiv宿主因素的流程

  3. 确认在人类初级t细胞中的hiv候选依赖因素
  4. 敲除与hiv整合相关的ledgf基因,设计,6个crrna用于检测并确认ledgf基因敲除对人类t细胞的影响。为了有更明显的效果,用另外一种感染方式使用效率最高的crrna对人类初级t细胞进行感染(图2)。
    对人类初级t细胞进行病毒感染

【结论】

  1. 在dna水平和蛋白水平证实了cas9 rnps成功的对细胞的基因组进行了修饰;
  2. 应用cas9 rnps高通量平台去高效准确的敲除cxcr4和ccr5基因;
  3. 6个crrna对ledgf基因敲除结果显示(图3和图4),其中两个crrna可以使蛋白表达明显降低,使用其他感染方式对细胞进行感染后发现,3天后细胞内病毒的复制有2~7倍的降低;7天后,效果更加明显,细胞内病毒复制有6~12倍的降低;
  4. ledgf基因蛋白表达量
    ledgf基因蛋白表达量

  5. tnpo3基因和ledgf基因敲除后,细胞可以避免病毒感染(图5)。由此可以证明tnpo3基因和ledgf基因是hiv病毒的依赖因素;
  6. tnpo3基因和ledgf基因表达量

  7. 单独使用cas9 rnps敲除cxcr4基因和cd4+基因与同时敲除两个基因,两者间基因编辑效率没有差别(图6);
  8. cxcr4基因与cd4+基因的基因编辑效率

  9. 同时使用cas9 rnps对cxcr4和ledgf基因进行敲除,结果显示单独敲除cxcr4和ledgf基因或者成对敲除两个基因之间的效率是相同的(图7)。由此说明,cas9 rnps多重编辑平台可以高效的一站式对成对的基因进行敲除,与单独敲除方法相比效率不变;
  10. cxcr4和ledgf基因进行敲除效率

  11. 使用crispr-cas9 rnps高通量平台可以对人类t细胞系统进行筛选及高通量表型分析,因此对已发表的文献中提到的45个直接或者间接与hiv整合酶相关的基因进行筛选。针对45个基因设计了146个sgrna,培养48 h时间后使用hiv病毒感染,2~6天后观察结果发现,cxcr4、cdk9、ledgf、gemin2、kpna1、kpna5、kat2a、fam96b、unc45a基因敲除后可以抑制hiv病毒的感染。而smarcb1、xrcc6基因的敲除导致hiv病毒感染的增强;plod1、sucla2、hdgfrp2、eeef1a1四个基因至少在一个个体中成为hiv病毒感染的潜在因素(图8)。
  12. 高通量平台对人类t细胞系统的进行筛选及表型分析结果

crispr-cas9服务订购

  1. email:请将您的详细需求发送到support@synbio-tech.com
  2. 电话订购:您可以直接拨打免费热线4000-973-630转803联系经验丰富的工程师
  3. qq咨询:任何技术问题均可与在线互动,泓迅科技官方企业qq:4000-973-630
  4. 关注泓迅科技微信公众号:szhxswkj;按照“姓名+学校/名称+联系方式”给留言,即可免费获取“crispr-cas9基因编辑技术应用手册”。

参考文献

hultquist, j.f., et al., a cas9 ribonucleoprotein platform for functional genetic studies of hiv-host interactions in primary human t cells. cell rep, 2016.17(5): p. 1438-52.