使用crispr-cas9技术对人类t细胞进行编辑

【背景】

t细胞作为人体重要的免疫细胞,对人体的免疫调节起到重要的作用,如果能够对t细胞的基因组成功进行编辑,那么对癌症、hiv、免疫缺陷疾病和自身免疫病治疗则可以从细胞水平进行治疗。目前,crispr-cas9基因编辑技术可以对多种细胞类型的基因组进行编辑,但是对于人类的t细胞还有一定难度,尤其是对t细胞的基因组进行替换性的基因修饰。本文通过优化crispr-cas9技术,预先将cas9蛋白与sgrna在体外组装成cas9 rnps,再将cas9 rnps转入到细胞中对基因组进行敲除/敲入。本文成功地完成了对人类cd4+ t细胞中的hiv病毒的共同受体cxcr4蛋白和免疫抑制蛋白pd-1的基因靶点的编辑,经过精确编辑后的人体cd4+ t细胞数量得到增加,因此有望于应用于人体的免疫治疗中。这种基于crispr rnps的基因治疗方法,可以人为的对天然的t细胞进行特异性改造,为肿瘤、免疫疾病等多种人类重大疾病的治疗带了新的方法和思路。

【方法】

  1. 使用电穿孔的方法将cas9 rnps导入到细胞内,敲除人类cd4+ t细胞表面cxcr4基因的外显子区域(图1);
  2. cas9 rnps转入人类cd4+ t细胞的实验流程

  3. 针对cxcr4基因设计单链dna模板用于同源重组修复(图2),替换原序列中的12个碱基,并加入hind iii酶切位点用于验证目标序列是否替换成功;
  4. 根据cxcr4基因设计hdr模板

  5. 针对pd-1基因的第一个外显子设计单链dna模板,替换原序列的12个碱基,并引入了hind iii酶切位点用于后续验证(图3)。
  6. 根据pd-1基因设计hdr模板

【结论】

  1. 经过t7e1方法确定cas9 rnps可以成功编辑t细胞基因组中的cxcr4基因,从而也对人类cd4+ t细胞中的蛋白表达造成影响。同时,流式细胞仪能够丰富被编辑过的t细胞的数量,为cas9 rnp应用于t细胞提供一种有效的工具;
  2. 经过hind iii酶验证方法得知,基因敲入的目标序列被hind iii酶切割形成2条新的短序列,由此说明cas9 rnps结合hdr模板可以精确地对人类t细胞中cxcr4基因和pd-1基因进行替换性的基因修饰(图4和5);
  3. cxcr4基因修饰后hind iii酶切后凝胶电泳结

  4. 通过体外组装cas9 rnps可以实现对人类cd4+ t细胞有效的基因组编辑,包括对人类cd4+t细胞中cxcr4和pd-1的基因修饰。

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参考文献

  1. schumann, k., et al., generation of knock-in primary human t cells using cas9 ribonucleoproteins. proc natl acad sci u s a, 2015. 112(33): p. 10437-42.